摘要：為了探討液氮超低溫保存技術(shù)廣泛應(yīng)用于園林花卉種子保存的可能性，對(duì)18個(gè)科47種花卉種子進(jìn)行了液氮超低溫保存研究。除了兩種花卉種子進(jìn)入液氮后炸裂外，其余45種花卉種子保存后都有一定發(fā)芽率，有些花卉種子保存后種子發(fā)芽率還高于保存前。MVE液氮罐

結(jié)果表明：?液氮超低溫保存技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于園林花卉的種子保存。?花卉種子在自然含水量狀態(tài)即可存于液氮中。? 從液氮中取出后，采用35～40°C溫水浴化凍有較高的發(fā)芽率。? 液氮超低溫保存對(duì)一些花卉種子萌發(fā)表現(xiàn)出促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：液氮超低溫保存，種子，園林花卉，種質(zhì)保存

我國(guó)具有豐富的園林花卉種質(zhì)資源，它們是我國(guó)園林發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。但是目前保護(hù)力度不夠，大量?jī)?yōu)良的種質(zhì)不斷喪失。與國(guó)外多層次、高安全系數(shù)、多種技術(shù)并存的種質(zhì)保存體系相比，更是有較大的差距。因此，研究園林花卉種質(zhì)保存技術(shù)研究有重要意義。

液氮超低溫保存是一種新的生物技術(shù)，應(yīng)用于植物種質(zhì)資源保存實(shí)踐僅20多年的歷史。它是采用一定的技術(shù)將植物材料安全保存在液氮(-196oC)中，需要時(shí)采用一定方法使之回到常溫并正常生長(zhǎng)的一整套生物技術(shù)。被認(rèn)為是目前實(shí)現(xiàn)生物種質(zhì)永久保存的唯一途徑而廣泛應(yīng)用。目前已成功應(yīng)用于植物種子、花粉、器官、組織及懸浮細(xì)胞等組織培養(yǎng)物的保存。但是目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)園林花卉種子的液氮超低溫保存技術(shù)研究不多，主要集中在農(nóng)作物和蔬菜上。

為了探討該技術(shù)在園林花卉種子保存中應(yīng)用的可能性和廣泛性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)18個(gè)科47種花卉種子進(jìn)行了液氮超低溫保存研究，旨在探討這些花卉種子液氮超低溫保存的技術(shù)方法和該技術(shù)應(yīng)用的廣泛程度。

1、材料與方法

1.1 材料

供試花卉種子購(gòu)于北京仁生制種公司。目錄如下：

 

 

1.2 方法

1.2.1 花卉種子含水量的測(cè)定

參照，用烘干法測(cè)定種子含水量。重復(fù)兩次，差值不超過(guò)0.02%。

1.2.2 花卉種子干燥方法

采用用硅膠干燥法。將種子放入盛有硅膠的干燥器中，根據(jù)種子含水量及脫水速度，確定放入不同時(shí)間以降低其含水量，達(dá)到所要求的種子含水量時(shí)取出供實(shí)驗(yàn)用。

1.2.3 種子液氮超低溫保存方法

將種子放入Effendorf 試管中，每份30～50粒，蓋緊蓋子，直接投入液氮(-196oC)中。10min 后將種子從液氮中取出解凍。采用快速或慢速兩種化凍方法。快速化凍是將種子在40oC溫水浴中放置6～7min。慢速化凍是將種子置于25±2 oC的室溫中30min 左右。

1.2.4 種子發(fā)芽率的測(cè)定

中、小粒花卉種子在30oC溫水中浸種24h，微粒種子在濕濾紙上放置過(guò)夜，然后在發(fā)芽箱中萌發(fā)。為方便對(duì)比，每個(gè)萌發(fā)芽皿中一半放置對(duì)照組種子，另一半放置液氮保存后化凍的種子，每份各30粒。重復(fù)兩次。

記錄10天內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)，然后計(jì)算萌發(fā)種子數(shù)占種子總數(shù)的百分比為種子發(fā)芽率。發(fā)-2-1芽條件：18oC ，光照強(qiáng)度50umol/ms，相對(duì)濕度93%。

2、結(jié)果與分析

2.1 花卉種子液氮超低溫保存結(jié)果

液氮超低溫保存技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究中，以實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)入液氮后一定時(shí)間，取出后材料有一定的生活力來(lái)判定保存方法的成功與否 。存入液氮的時(shí)間從5min.到幾天甚至幾年不等，本實(shí)驗(yàn)中放置10min ，除羽葉蔦蘿和銀邊翠種子進(jìn)入液氮后炸裂外，其余45種花卉種子經(jīng)液氮處理后都有一定的發(fā)芽率。表明這些花卉種子實(shí)現(xiàn)了液氮超低溫保存。液氮保存對(duì)花卉種子發(fā)芽率的影響見(jiàn)表2。

從表2中可以看出，液氮保存對(duì)花卉種子發(fā)芽率影響不同。與對(duì)照組相比，有些花卉種子發(fā)芽率提高，而有的降低;不同的花卉種子與對(duì)照組種子發(fā)芽率的差異也不同。提高者(編號(hào)1～21的花卉)從高于對(duì)照組1%(鳳仙花、粉紅雞冠、千日紅、蛇目菊)～28%(彩葉草)不等,占實(shí)驗(yàn)用液氮保存成功花卉總數(shù)的46.7%;其中種子發(fā)芽率高于對(duì)照組5%以上的花卉占總數(shù)的24.4%，高于對(duì)照組10%以上的花卉占總數(shù)的11.1%。降低者(編號(hào)22～45的花卉)從低于對(duì)照組1%(石堿花)～31%(硫華菊)不等，占實(shí)驗(yàn)用液氮保存成功花卉總數(shù)的53.3%;其中種子萌發(fā)率低于對(duì)照組5%以上的花卉占37.8%，低于對(duì)照組10%以上的花卉占17.8%。即液氮保存后花卉種子發(fā)芽率與對(duì)照組差異在5%以內(nèi)的花卉約占總數(shù)的37.8%，而62.2%的花卉種子發(fā)芽率較明顯高于或低于對(duì)照組(差值在5%以上)。

結(jié)果表明，液氮超低溫保存后種子發(fā)芽率與種子保存前花卉種子自身發(fā)芽率有很大關(guān)系。超低溫保存對(duì)花卉種子發(fā)芽率也有一定影響。對(duì)一些花卉種子萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用，如彩葉草提高了28%、矮秋葵提高了17%、飛燕草和‘五彩翠菊’提高了14%、;而使另一些花卉種子發(fā)芽率明顯降低，如硫華菊降低了31%、早小菊降低了22%、矮雪輪降低了21%、金光菊降低了18%、觀賞罌粟和大花牽牛降低了16%、金魚(yú)草降低了15%。但71.1%的花卉種子液氮超低溫保存前后，種子發(fā)芽率與對(duì)照組相比，差值在10%以內(nèi)。說(shuō)明液氮超低溫保存方法是適合園林花卉種子保存的。

 

 

 

2.2 種子含水量對(duì)液氮超低溫保存后種子發(fā)芽率的影響

液氮超低溫保存中，所保存材料的含水量一直是人們給予特別重視的方面，認(rèn)為它可能是超低溫保存成敗的關(guān)鍵因子，不同的植物種子都有一個(gè)適宜的含水量范圍。實(shí)驗(yàn)中對(duì)自然含水量的花卉種子進(jìn)行干燥，然后進(jìn)行液氮超低溫保存實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

 

 

表3結(jié)果顯示，液氮超低溫保存對(duì)干燥過(guò)的花卉種子發(fā)芽率的影響與對(duì)自然含水量種子一致，既液氮超低溫保存后有些花卉種子發(fā)芽率高于對(duì)照組(帶#者)，而大多數(shù)(58.3%)降低(帶*者)或不變(5號(hào)天人菊)。而自然含水量種子經(jīng)液氮超低溫保存后發(fā)芽率降低者達(dá)53.3%(見(jiàn)表2)，表明液氮保存不論是對(duì)干燥過(guò)種子亦或是對(duì)自然含水量種子質(zhì)量都有一定影響，使大多數(shù)種子發(fā)芽率降低。

表3還可以看到, 對(duì)照組花卉種子從自然含水量干燥到一般低溫保存所要求的安全含水量4%～8%左右時(shí)，種子發(fā)芽率呈三種不同變化趨勢(shì)。表3中羽衣甘藍(lán)等編號(hào)1～6 的花卉，其種子干燥后發(fā)芽率提高(從1%～11%不等)，這類花卉占該實(shí)驗(yàn)用花卉總數(shù)的28.6%(指種子含水量降到5%左右的花卉總數(shù));編號(hào)7～9的硫華菊、麥稈菊、粉紅雞冠種子發(fā)芽率保持不變，這類花卉占總數(shù)的14.3%;大花牽牛等編號(hào)10～21的花卉種子干燥后，種子發(fā)芽率降低，(1%～42%不等)，這類花卉占總數(shù)的57.1%。結(jié)果表明約有半數(shù)以上花卉種子在從自然含水量向低溫保存的安全含水量干燥過(guò)程中，發(fā)芽率會(huì)降低，說(shuō)明干燥過(guò)程對(duì)大多數(shù)花卉種子質(zhì)量有一定不良影響;而對(duì)一些花卉種子萌發(fā)則有促進(jìn)作用或影響不大。編號(hào)22～24的花卉種子干燥到低溫保存的安全含水量以下時(shí)(本實(shí)驗(yàn)為3.2%)，發(fā)芽率皆明顯低于對(duì)照，表明過(guò)度干燥明顯影響種子質(zhì)量，降低發(fā)芽率。

但是干燥對(duì)種子發(fā)芽率的影響在液氮保存前后并不完全一致。本實(shí)驗(yàn)中1～21號(hào)花卉種子含水量降到5%左右，黑心菊、早小菊、硫華菊、麥稈菊、粉紅雞冠、金光菊6種花卉，液氮保存后種子發(fā)芽率皆高于液氮保存的自然含水量種子(帶※者,從5%到22%不等)，似乎干燥有利于液氮超低溫保存;而液氮保存前，干燥對(duì)這些花卉種子發(fā)芽率影響不同，使黑心菊、早小菊提高，沒(méi)有影響硫華菊、麥稈菊、粉紅雞冠，降低了金光菊的種子發(fā)芽率。但71.4%的花卉種子干燥到含水量為5%時(shí)再進(jìn)行液氮超低溫保存，發(fā)芽率較自然含水量種子液氮保存后低，如石堿花，自然含水量為5.40%時(shí)，種子發(fā)芽率為6%，液氮保存后發(fā)芽率為5%;當(dāng)種子含水量降到4.30%時(shí)，種子發(fā)芽率已下降到3%，液氮保存后發(fā)芽率為0，未能實(shí)現(xiàn)液氮超低溫保存，見(jiàn)表3，似乎干燥不利于液氮超低溫保存。這樣的結(jié)果說(shuō)明干燥和液氮保存這兩個(gè)過(guò)程對(duì)種子發(fā)芽率影響的相對(duì)獨(dú)立性和復(fù)雜性。但有一點(diǎn)可以肯定，對(duì)大多數(shù)花卉而言，干燥種子對(duì)液氮超低溫保存后種子發(fā)芽率不利，即使干燥本身能提高種子發(fā)芽率。

花卉種子進(jìn)一步干燥到含水量更低，情況與上述結(jié)果相似，見(jiàn)表3。 編號(hào)為22～24 的‘矮翠菊’、矢車(chē)菊、‘五彩翠菊’。當(dāng)種子含水量降低到3.5%左右時(shí)，‘矮翠菊’和矢車(chē)菊種子發(fā)芽率明顯低于對(duì)照組種子，但液氮保存后，‘矮翠菊’種子發(fā)芽率高于其對(duì)照組種子液氮超低溫保存后種子發(fā)芽率，而矢車(chē)菊則明顯降低。‘五彩翠菊’則表現(xiàn)出一致，即種子干燥后，發(fā)芽率由對(duì)照的64%升高到72%;液氮超低溫保存后發(fā)芽率由對(duì)照組的78%上升到80%。

上述結(jié)果表明，花卉種子含水量對(duì)液氮超低溫保存效果有一定影響。不同含水量花卉種子超低溫保存后種子發(fā)芽率不同。有些花卉種子在自然含水量狀態(tài)下進(jìn)行液氮保存有較高的發(fā)芽率，而有些則進(jìn)行干燥后進(jìn)行液氮超低溫保存有較高的發(fā)芽率。而干燥對(duì)種子發(fā)芽率影響在液氮超低溫保存前后并不完全一致。

2.3 化凍方式對(duì)液氮超低溫保存的影響

液氮超低溫保存中，冰凍傷害有時(shí)在冰凍過(guò)程中不發(fā)生，但在解凍過(guò)程中發(fā)生。因此，化凍方法對(duì)液氮超低溫保存技術(shù)研究非常重要。實(shí)驗(yàn)中采用種子從液氮中取出后在室溫和溫水浴中兩種不同化凍方法。結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4中可以看出，化凍方式對(duì)液氮超低溫保存后種子發(fā)芽率有明顯影響，溫水浴化凍的種子，其發(fā)芽率高于室溫化凍。僅就本實(shí)驗(yàn)用的花卉來(lái)看，花卉液氮超低溫保存中，快速化凍優(yōu)于室溫化凍。MVE液氮罐